Der Auftrag ist klar: Für Captain „Duke“ Hauser (Channing Tatum) und seinen Partner Wallace „Ripcord“ Weems (Marlon Wayans) geht es darum, mit zerstörerischen Nanobots bestückte Sprengköpfe aus einer Fabrik des MARS-Konzerns in Kirgistan zu eskortieren. Die Mission scheitert jedoch. Die stets in Lack und Leder gekleidete Terroristin Baroness (Sienna Miller), die für die Geheimorganisation COBRA arbeitet, überfällt den Konvoi. Doch bevor sie mit den High-Tech-Waffen entkommen kann, taucht G.I. Joe auf und rettet den Tag. Unter der Leitung von General Clayton „Hawk“ Abernathy (Dennis Quaid) hat es sich die aus Topagenten wie dem Waffenspezialisten Hershel „Heavy Duty“ Dalton (Adewale Akinnuoye-Agbaje) oder der Nachrichtenoffizierin Shana „Scarlett“ O’Hara (Rachel Nichols) zusammengesetzte Spezialeinheit auf die Fahnen geschrieben, den internationalen Terrorismus in seinen Grundfesten zu erschüttern. Duke und Ripcord sind begeistert von den scheinbar endlosen technischen Möglichkeiten der Einheit (von flüssigen Nano-Rüstungen bis zum Beschleunigungs-Kampfanzug Delta-6 ist hier alles zu haben) und treten G.I. Joe nur allzu gerne bei. Da Baroness und COBRA aber keine Ruhe geben, sind die ruhigen Tage schnell gezählt.
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