Die alte Killerin ist desertiert und eine neue Femme Fatale muss ausgebildet werden ... Über zehn Jahre ist es her, dass Nikita (Maggie Q) von einer geheimen Spionagebehörde der amerikanischen Regierung, nur „Division“ genannt, unfreiwillig zur Auftragsmörderin ausgebildet wurde. Vor drei Jahren gelang ihr die Flucht vor ihren Ausbildern, dem Chef der Division Percy (Xander Berkeley) und dessen rechter Hand Michael (Shane West). Ständig von den Killern der Behörde verfolgt, versucht Nikita die Division zu vernichten und beginnt, mit Hilfe eines Maulwurfs deren Aufträge zu sabotieren. Gleichzeitig wird die junge Alex (Lyndsy Fonseca) nach einem Raubüberfall mit tödlichem Ende von der Division aus dem Gefängnis geholt und soll nun ebenfalls die Ausbildung zur Killerin durchlaufen.