Harley Quinn (Stimme im Original: Kaley Cuoco) hat es satt, im Schatten des Jokers (Alan Tudyk) zu agieren. Fortan will die verrückte Psychologin eigene Wege gehen und trennt sich von ihrem psychopathischen Begleiter. In der festen Überzeugung, dass sie selbst die Unterwelt von Gotham City dominieren kann, begibt sie sich auf Solopfade und stiftet Chaos und Verwüstung. Auf ihren Streifzügen lernt sie jedoch bald die Legion of Doom kennen, zu der unter anderem Poison Ivy (Lake Bell), Clayface (Alan Tudyk), King Shark (Ron Funches) und Sy Borgmann (Jason Alexander) zählen. Um sich einen Platz in der illustren Truppe zu sichern, muss sich Harley aber erst beweisen. Die Chance erhält sie, als andere Kriminelle für Ärger sorgen und auch der Dunkle Ritter Batman (Diedrich Bader) die Gruppe ins Visier nimmt. Nun muss Harley zeigen, welche Power in ihr steckt und ob sie wirklich das Zeug zur gefürchteten Boss Lady hat.