Harley Quinn (Stimme im Original: Kaley Cuoco) wil sich aus dem Schatten ihres Wegbegleiters Joker (Alan Tudyk) lösen. Sie selbst will für Angst und Schrecken in Gotham City sorgen und zieht allein durch die Straßen der düsteren Metropole. Auf ihren Streifzügen lernt sie die Mitglieder der Legion of Doom kennen, zu der unter anderem Poison Ivy (Lake Bell), Clayface (Alan Tudyk), King Shark (Ron Funches) und Sy Borgmann (Jason Alexander) zählen. Für Harley ist klar: Sie will unbedingt Teil dieser Truppe werden!