Eugene Levy wurde am 17. Dezember 1946 in Hamilton im kanadischen Bundesstaat Ontario geboren und ging auf die Westdale Secondary School. Gemeinsam mit Ivan Reitman studierte er an der McMaster University in Hamilton Filmwissenschaften.

Er begann seine Karriere als Komödiant Anfang der 70er Jahre in Comedy-Serien im kanadischen Fernsehen, bei denen er meist bekannte Persönlichkeiten parodierte. In den frühen 80er Jahren wurde er für einige Episoden mit dem Emmy ausgezeichnet. Levy hatte zwar nur in wenigen Filmen eine Hauptrolle, 1973 in der Horror-Komödie „Cannibal Girls“, 1986 in „Zwei unter Volldampf“ und 2005 in „Cool & Fool – Mein Partner mit der großen Schnauze“, daneben jedoch zahlreiche Nebenrollen. Seine Karriere erhielt einen gewaltigen Schub, als er 1999 in der erfolgreichen Teenie-Komödie „American Pie“ als schrulliger und meist peinlicher Film-Vater von Jason Biggs gecastet wurde. Die gleiche Rolle spielte er auch in allen Nachfolge-Titeln. Damit ist Levy der einzige Schauspieler, der in allen acht „American Pie“-Filmen mitspielte.

Zusammen mit Christopher Guest und Michael McKean wurde er für den Titelsong aus „A Mighty Wind“ mit dem Grammy ausgezeichnet. Als Teil der kanadischen Komiker-Truppe SCTV, mit der Levy am Anfang seiner Karriere bekannt wurde, erhielt er einen Stern auf dem kanadischen Walk of Fame. Zudem ist Levy einer der wenigen, die mindestens fünf Canadian Comedy Awards erhielten, darunter zwei für das beste Drehbuch und drei als bester Schauspieler.