Peter Parker (Andrew Garfield) wurde noch während seiner Kindheit von seinen Eltern verlassen. Sein Onkel Ben (Martin Sheen) und seine Tante May (Sally Field) nahmen ihn daraufhin bei sich auf. Heute führt er ein Leben als High-School-Außenseiter, versteht sich jedoch gut mit seiner Jugendliebe Gwen Stacy (Emma Stone). Als Peter einen mysteriösen Aktenkoffer findet, der offensichtlich einst seinem Vater gehörte, macht er sich auf, herauszufinden, wie und warum seine Eltern damals verschwanden. Die Spur führt ihn direkt zu Oscorp Industries und Dr. Curt Connors (Rhys Ifans), dem ehemaligen Partner seines Vaters. In der Forschungsanlage nehmen die Dinge, die sowohl Peters als auch Dr. Connors Leben für immer verändern werden, ihren Lauf und Peter muss sein Schicksal akzeptieren, ein Held zu sein...
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