Zwei Jahre sind vergangen, seit Peter Parker (Tobey Maguire) seine große Liebe Mary Jane (Kirsten Dunst) abweisen musste. Er hat sich für ein Leben als Superheld entschieden, und da ist eben kein Platz für eine Beziehung. Um genau zu sein, ist da kaum Platz für irgendetwas anderes als für "Spider-Man"-Missionen, weswegen Peters Leben von großer Hektik geprägt wird: Nebenjob, Studium und das Beschützen von New Yorks Bewohnern, all das lässt sich einfach nicht in gleicher Qualität leisten. Peter beschließt also, das Heldendasein zu beenden und wirft sein Kostüm in den nächstbesten Mülleimer. Dies geschieht zum denkbar ungünstigsten Zeitpunkt, denn eine neue Bedrohung ungekannten Ausmaßen zieht heran. Der eben so geniale wie sympathische Wissenschaftler Dr. Otto Octavius (Alfred Molina) arbeitet für Oscorp, das mittlerweile von Harry (James Franco) geführt wird, an der Entwicklung einer neuen, revolutionären, niemals versiegenden Energiequelle. Ein nobles Ziel. Als jedoch eines seiner Experimente vollkommen misslingt, verliert er durch die tragischen Begleitumstände und einen technischen Defekt an einer seiner Apparaturen vollkommen den Verstand. Doc Ock ist geboren. Ein gefährlicher Gegner, dem - wenn überhaupt - nur Spider-Man gewachsen ist...
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